Antikörper-Nachweismethoden

ELISA

= Enzyme-linked immuno sorbent assay

Zum Nachweis von Ag oder AK, z.B. zur Bestimmung des Impfschutzes (Titerbestimmung)

Zum AK-Nachweis:

1. Kunststoffplatte wird mit Ag (z.B. einerm Virus-Hüllenprotein) beschichtet (bei Nachweis eines Antigens würde man mit monoklonalem Antikörper beschichten). Das Protein bindet dabei fest an die Platte.
2. Überschichten mit dem zu untersuchenden Serum (Testserum), Inkubation.
   Falls AK gegen das Ag vorhanden sind, binden sie an dieses.
3. Auswaschen von überschüssigem Serum und von nicht gebundenem AK.
4. Überschichten mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen den Fc-Abschnitt eines humanen IgG gerichtet ist (anti-human IgG-AK), und an den ein Enzym gebunden ist, das bei Interaktion des Anti-AK mit humanem IgG eine Farbreaktion aufweist.
   Alternativ: Ein Enzym-markierter AK gegen den Anti-human-IgG-AK
5. Auswaschen von nicht gebundenem Anti-AK.
6. Zugabe des Substrats für die Enzym-Farbreaktion (Chromogenlösung) ==> Wenn AK im Serum vorhanden waren (und daher Enzym-markierte AK gebunden sind), wird das durch eine Farbreaktion angezeigt.

Der Versuchsansatz wird in einer Verdünnungsreihe durchgeführt, wodurch die relative Menge an AK im Serum bestimmt werden kann. Diejenige Verdünnung, bei der gerade noch eine Farbreaktion auftritt, ist der AK-Titer (genauer: Der Kehrwert der Verdünnung)

Wenn also bei einer Verdünnung von 1 : 10 000 der Test noch positiv war, dann weist der Patient einen AK-Titer gegen das Testantigen von 10 000 auf.

Je höher der Titer (d.h. je mehr verdünnt das Patientenserum), umso höher ist die Konzentration an Ag-spezifischen Antikörpern.

Anwendung: z.B. zur Bestimmung des Impfschutzes gegen Hepatitis B

Variante:

Statt eines markierten Anti-IgG-AK wird gleichzeitig mit dem Testserum (Schritt 2) ein Tracer zugegeben, der im Prinzip ein Enzym-markierter AK gegen das Antigen ist. Die Serum-AK und der Tracer konkurrieren dann um Bindungsstellen auf dem Ag. Nach dem Auswaschen von Serum und Tracerlösung und Zugabe der Chromogenlösung tritt wieder eine Farbreaktion auf. Hier ist die Stärke der Farbreaktion aber reziprok zur AK-Konzentration im Serum.

RIA (Radioimmumo-assay)
RAST (Radio allergosorbent test)

Diese Methoden funktionieren im Prinzip wie der oben erklärte ELISA-Test, nur werden hier radioaktiv markierte Antikörper statt der Enzym-markierten AK eingesetzt. Die Auswertung erfolgt in einer Zählkammer: die gemessene Radioaktivität ist proportional der gebundenen AK-Menge.

RAST ist eine Spezialform des RIA und ist eine sensitive Testmethode zum Nachweis von Allergen-spezifischen IgE-Antikörpern.

Immunfluoreszenz (IF)

Bei dieser Methode können auch in Gewebeschnitten oder auf Einzelzellen vorkommende Antigene oder Antikörper nachgewiesen werden. Dabei werden mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte AK verwendet.

Man unterscheidet:

• direkte IF:

Ein Gewebeantigen oder an Gewebeantigene gebundene AK werden mit einem fluoreszierenden AK dargestellt

• indirekte IF:

Ein Gewebestück wird mit dem zu testenden Serum inkubiert, gebundene AK werden durch einen floureszierenden Zweit-AK dargestellt.

Verwendung: Diagnostik des Pemphigus vulgaris, des bullösen Pemphigoids, Nachweis von Immunkomplexablagerungen beim SLE.

Bei der Immunhistochemie werden Ag bzw. AK durch enzymatische Farbreaktionen nachgewiesen und können im Lichtmikroskop beurteilt werden.

Western Blot

Mit dieser Methode kann bestimmt werden ob und gegen welches Antigen einer Proteinmischung spezifische AK im Serum vorhanden sind.

1. Ein Proteingemisch, das verschiedene potentielle Ag enthält (und zusätzlich mitgeführte Kontrollproteine), wird mittels Gel-Elektrophorese aufgetrennt.
2. Nach der Auftrennung werden die Proteinbanden auf eine Nitrozellulose-Membran "geblottet" (d.h. es entsteht quasi ein Abklatschbild ), die Proteine binden an die Nitrozellulose-Membran.
3. Die Membran wird mit Patientenserum inkubiert.
   Falls spezifische AK gegen eines der der Proteine vorhanden sind, dann binden diese genau an der Proteinbande, die diesem Proteinantigen entspricht.
4. Analog zu ELISA oder RIA wird wiederum mittels eines markierten Zweitantikörpers die Ag-AK-Bindung detektiert.

Das Molekulargewicht der Bande kann an den mitgeführten Kontrollproteinen abgelesen werden.

Auch der Nachweis von Antigenen ist möglich: Dabei werden monoklonale AK zum Nachweis eines speziellen Antigens in einem Proteingemisch verwendet.

Durchflusszytometrie (FACS)